Recuento de enterococos fecales por filtración

RECUENTO DE ENTEROCOCOS FECALES POR FILTRACIÓN

PRÁCTICA 11

1.- OBJETIVO:

Recontar enterococos fecales en el medio agar Slanetz-Bartley y hacer la siembra mediante filtración con kitasato 100ml. 50 muestra/50 agua estéril.

2.- FUNDAMENTO:

Slanetz-Barley es un medio muy selectivo indicado para aislamiento y recuento de enterococos fecales en agua y en alimentos, con la técnica de filtración de membrana o con el método de siembra en superficie (no crece E. coli).

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Preparamos el lugar de trabajo montando el matraz kitasato con sus partes y el aparato de vacío. También encendemos el mechero bunsen ya que necesitamos condiciones de esterilidad.

2.- Teniendo el agua muestra ya preparada, preparamos en un vaso de precipitado alcohol para  flamear las pinzas y en la placa Petri estéril ponemos agua destilada estéril para dejar el filtro que vamos a usar y que se despegue la parte sobrante.

3.- Para coger el filtro flameamos primero las pinzas con cuidado, cogemos le filtro y lo pasamos a la placa Petri con el agua estéril hasta que se despegue bien el trozo sobrante del filtro.

4.- Vamos a poner el filtro encima del Kitasato y cerramos con el embudo para filtrar, ponemos las pinzas de seguridad para que no se vaya a caer el embudo  y hacer mejor la filtración.

5.- Encendemos la bomba de vacío, el agua irá pasando por el filtro, en este paso asegurarnos que todo el aparato de filtrado está bien apretado sino la aspiración será escasa y tardará más.

6.- Al terminar retirar pinzas de sujeción, embudo y coger el filtro con las pinzas (previamente esterilizadas flameándolas).

7.- Se deja el filtro en la placa Petri del medio agar Slanetz-Bartley lentamente para no hacer burbujas entre el medio y el filtro.

8.- Rotular la placa con los datos necesarios sobre el recuento que se está realizando, fecha y persona.

9.- Guardar el cultivo boca abajo y a una temperatura de 44ºC durante 18-24 horas.

4.- MATERIALES:

- Mechero

- Vasos de precipitado (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

- Embudo

- Probeta 100 ml

- Pipeta Pasteur

- Matraz Kitasato

- Alcohol

- Agua Destilada Estéril

- Placa Petri estéril

- Pinzas

- Mechero Bunsen

- Filtro reticulado

- Placa Petri con cultivo Slanetz-Bartley

5.- RESULTADOS:

Salieron menos de 30 colonias, por lo que no se pueden contar.

Recuento en placa de salmonella

RECUENTO EN PLACA DE SALMONELLA

PRÁCTICA 8

1.- OBJETIVO:

Realizar una siembra de césped en verde brillante y recontar las colonias que crezcan.

2.- FUNDAMENTO:

El verde brillante es un medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria.

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Preparamos nuestro lugar de trabajo con los materiales y desde el principio usamos el mechero bunsen para crear las condiciones de esterilidad necesaria para un cultivo.

2.- Con los cuatro tubos puestos en la gradilla, los rellenamos con 9ml cada uno de agua destilada estéril que cogeremos con una pipeta también estéril.

3.- Seguidamente cogemos 1 ml de agua de muestra con la micropipeta y la echamos sobre el primer tubo, con la boquilla estéril.

4.- Con la misma boquilla estéril, cogemos 1ml de la primera dilución y lo pasamos al segundo tubo donde ahora tendremos una dilución 1/100 y así respectivamente con el tubo 3(1/1000) y tubo 4(1/10.000).

5.- Importante cada vez que se pasa al siguiente tubo, mezclar bien el tubo para que se haga homogénea la mezcla y que se haga bien la siguiente dilución.

6.- Tendremos una placa preparada de medio Verde Brillante en la que sembraremos 1ml de cada dilución. Rotular en cada una qué dilución se ha puesto para después comprobar el resultado. En el primer tubo, pondremos que es la 1/10.

7.- La siembra se hace con el asa de Digralsky, esparciendo por la placa el líquido de la dilución. Es importante flamear el asa en alcohol antes y después de usarla para seguir con las condiciones de esterilidad.

8.- Se hace moviendo el asa en círculos, y girando la placa para que llegue a todas las zonas la dilución.

9. Lo dejamos secar bien y metemos en la estufa a 37ºC y boca abajo.

4.- MATERIALES:

- Medio Verde Brillante

- Asa de siembra de Digralsky

- Placas de petry

- Alcohol

- Mechero bunsen

- Micropipeta de 1ml

- Boquillas micropipeta esteriles

- Vasos de precipitado

- Pipeta estéril 10ml

- Agua destilada

- 4 Tubos de ensayo

- Mechero

- Gradilla

5.- CÁLCULOS:

264(colonias) · 10(tubo 1/10)/ 1 (ml de siembra)= 2640 UFC/ml Salmonella

Las otras placas eran menos de 30 colonias por lo que no se puede contar.

6.- RESULTADOS:

Nos salieron 264 colonias en el tubo 1/10 de Salmonella, y una colonia de E.Coli

2640 UFC/ml Salmonella 

Recuento aerobios mesófilos por filtración

RECUENTO AEROBIOS MESÓFILOS POR FILTRACIÓN

PRÁCTICA 9

1.- OBJETIVO:

Recuento de aerobios mésofilos presentes en el cultivo PCA y hacer la siembra mediante filtración
con kitasato.

2.- FUNDAMENTO:

Filtración al vacío mediante un kitasato para hacer pasar por un filtro de poro 0,45mm el agua y se retenga en el los microorganismos que queremos sembrar en el medio de cultivo PCA.

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Preparamos el lugar de trabajo montando el matraz kitasato con sus partes y el aparato de vacío. También encendemos el mechero bunsen ya que necesitamos condiciones de esterilidad.

2.- Con el agua muestra ya preparada, echamos en un vaso de precipitado alcohol para cuando tengamos que flamear las pinzas y en la placa Petri estéril ponemos agua destilada estéril para dejar el filtro que vamos a usar y que se despegue sola la parte sobrante.

3.- Flameamos primero las pinzas con cuidado para coger el filtro y lo pasamos a la placa Petri con el agua estéril hasta que se despegue bien el trozo sobrante del filtro.

4.- Ponemos el filtro encima del Kitasato y cerramos con el embudo para filtrar. Ponemos las pinzas de seguridad para que no se vaya a caer el embudo y hacer mejor la filtración.

5.- Encendemos la bomba de vacío, el agua irá pasando por el filtro, en este paso asegurarnos que todo el aparato de filtrado está bien apretado sino la aspiración será escasa y tardará más (como ya nos ocurrio).

6.- Al terminar retirar pinzas de sujeción, embudo y coger el filtro con las pinzas (previamente esterilizadas).

7.- Se deja el filtro en la placa Petri del medio PCA lentamente para no hacer burbujas entre el medio y el filtro.

8.- Rotular la placa con los datos necesarios sobre el recuento que se está realizando, fecha y persona.

9.- Guardar el cultivo boca abajo en la estufa y a una temperatura de 35-37ºC por ser mesófilos.

4.- MATERIALES:

- Mechero

- Vasos de precipitado (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

- Embudo

- Probeta 100 ml

- Pipeta Pasteur

- Matraz Kitasato

- Alcohol

- Agua Destilada Estéril

- Placa Petri estéril

- Pinzas

- Mechero Bunsen

- Filtro reticulado

5.- RESULTADOS:

Las colonias no se podían contar porque se encontraban muy juntas.

Siembra de cultivos

SIEMBRA DE CULTIVOS

PRÁCTICA 5

1.- OBJETIVOS:

Sembrar cultivos para contarlos posteriormente.

2.- FUNDAMENTO:

Inocular o sembrar en un medio artificial una muestra es lo fundamental para que finalmente podamos incubar dicho medio a cierta temperatura y que después podamos contarlo.

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Ponemos un mechero bunsen cerca de la mesa de trabajo donde vamos a hacer la siembra, esto nos dará condiciones de esterilidad necesarias para este proceso.

2.- Flameamos el asa que vayamos a usar en cada caso. Según el asa deberemos llevarla al rojo vivo o ponerla antes en alcohol para solo flamear un momento.

3.- Cogiendo con la mano no dominante el recipiente de la muestra procedemos a:

-En placa: Manteniéndola invertida se levanta cara la llama, se toma una porción de la colonia que queramos sembrar y se cierra la placa.

-En tubo: se sujeta el tapón con el meñique de la mano dominante y se flamea la boca del tubo para esterilizarlo, seguidamente se sumerge el asa y se remueve para coger las colonias, volvemos a flamear la boca del tuvo y cerramos.

4.- Volvemos a esterilizar el asa una vez terminado

• En medio líquido sumergimos el asa y agitamos para que se desprenda el inóculo.
• En medio semisólido vamos a usar una picadura hundiendo el asa y retirando posteriormente por el mismo trayecto.
• En tubo con medio sólido podemos hacerlo de diferentes formas: En tubo con agar horizontal que sería por picadura, en agar inclinado o slant (pico de flauta) que se desliza el asa haciendo un zigzag desde el fondo hacia la parte superior, aunque también se puede combinar empezando con picadura y terminando con zigzag.
• Cuando hablamos de siembra en placa, en medio sólido, con ella tendremos colonias de cada célula viable que plantemos en este caso es más amplio porque hay diferentes métodos de siembra.

-Por siembra de agotamiento en estría para aislar, tenemos dos formas: Estría simple con una sola línea en zigzag y con la siembra lo más lejos del operador, y la estría múltiple que se descarga de 3-4 veces en estrías, cada vez esterilizando el asa de siembra y dejando que se enfríe. En este caso es importante que la primera estría se junte con la segunda solo dos veces, la segunda con la tercera dos veces y la tercera con la cuarta solo una vez.

-La siembra en superficie, con césped o inundación, añadiendo un volumen conocido por una pipeta estéril y removiendo con asa Digralsky. Según dilución se podrá luego contar más o menos (no es lo mismo una dilución 1/10 que 1/1000).



Cuando vayamos a usar el horno o estufa es importante que esté a la temperatura necesaria para el cultivo que vayamos a usar, ya que no es lo mismo para mesófilos (35-37ºC) que termófilos (44ºC).

Determinación de carbonatos y bicarbonatos

DETERMINACIÓN DE CARBONATOS Y BICARBONATOS

PRÁCTICA 2

1.- OBJETIVO:

Volumetría por ácido-base y determinar la concentración en una muestra de carbonatos y bicarbonatos.

2.- FUNDAMENTO:

Determinar los equivalentes de una solución problema, y lo hacemos consiguiendo averiguar la cantidad de una solución patrón necesaria para llegar al punto de equivalencia. Tenemos tanto bicarbonatos como carbonatos, que son 2 bases débiles. Al estar disuelto en el agua su pH será mayor de 7. Para saber que cantidad de carbonatos y bicarbonatos se irá añadiendo HCl e iremos anotando la cantidad de HCl gastado y la variación de pH.

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Preparamos primero el ácido clorhídrico 0,1N por el cálculo

                                              Vi · Ci = Vf · Cf

2.- Cogemos agua de muestra con vaso de precipitado y la pasamos a probeta de 100ml y enrasamos con pipeta Pasteur.

3.- Pasamos de probeta a matraz Erlenmeyer y añadimos 5-8 gotas de fenolftaleína, si observamos que vira a rosa entonces hay carbonatos en la muestra.

4.- Usamos bureta graduada, primero limpiando con un poco del mismo reactivo que vamos a usar y seguidamente rellenamos y enrasamos con Pasteur el ácido clorhídrico.

5.- Dejamos caer a gotas el valorante de la bureta hasta que pase de rosa claro (presencia de Carbonatos) a transparente, entonces será la cantidad que se necesita para eliminar los carbonatos. 1,7 ml de valorante.

6.- Por último añadimos 3-5 gotas de naranja de metilo al agua muestra misma que hemos usado antes hasta que coja un tono amarillo pálido. Volvemos a enrasar la bureta con el mismo valorante y mismo procedimiento. La valoración concluye cuando vire a naranja, anotando de la bureta los ml gastados para que se produzca la reacción. 4,8 ml de valorante.

4.- MATERIAL Y REACTIVOS:

- Bureta graduada de 25 ml

- Papel de filtro

- Pipetas de 1 ml

- Matraces Erlenmeyer de 250 ml

- Prepipetas

- Vaso de precipitado de 100 ml

- Pipetas Pasteur

- Embudo

- Valorante - Ácido clorhídrico 0,1 N

- Indicador - Fenolftaleína

- Indicador - Naranja de metilo

- Agua de muestra

- Agua destilada

5.- CÁLCULOS:

Vi · Ci = Vf  · Cf  à Vi= 100 · 0,1 / 2 = 5ml

1,7ml · 60 = 102 mg/Carbonatos

4,8 ml · 61= 292,8 mg/Carbonatos

6.- RESULTADOS:

102 mg/ Carbonatos en el primer cálculo después de multiplicar por 60 el resultado de la bureta.

292,8 mg/Carbonatos cuando realizamos los bicarbonatos, se multiplica por 61 el resultado del valorante.

Determinación de cloruros

DETERMINACIÓN DE CLORUROS

PRÁCTICA 1

1.- OBJETIVO:

Realizar la determinación de cloruros por medio de una volumetría de precipitación.

2.- FUNDAMENTO:

Realizar esta determinación por el método de Mohr que se usa en aguas potables o superficiales.
Consiste en adicionar una solución de nitrato de plata en presencia de cromato de potasio como indicador. La formación de cromato de plata de color rojizo indica que ha finalizado la reacción. Se puede realizar mientras que las aguas no lleven excesivo color o turbidez.

3.- PROCEDIMIENTO:

1.- Tenemos que hacer el nitrato de plata, pesamos la cantidad que nos pide el problema y lo echamos al matraz aforado con ayuda de una espátula y embudo sobre una base de agua destilada. El resultado de AgNO3 que nos dío fue de 1,69gr.

2.- Rellenamos matraz aforado hasta enrasar con pipeta Pasteur.

3.- Mismo procedimiento para Cromato potásico. Tomamos 5 g, pesamos en vidrio de reloj, lo metemos en otro matraz aforado siguiendo los pasos anteriores y en este caso tendrá un color amarillento.

4.- Cogemos nuestra agua de muestra que vamos a analizar, de ahí la echamos a un vaso de precipitado y enrasamos hasta 100ml que es lo que nos pide.

5.- Al agua de muestra le añadimos CaCO3 suficiente para que quede amarillo pálido y con turbidez.

6.Añadimos 3 gotas de HNO3 para que se vuelva amarillo turbio.

7. Añadimos el valorante [AgNO3 en este caso] a la bureta, primero un poco para limpiarla cerrando la llave y abriendo para que suelte esa cantidad y ya llenamos hasta enrasar la bureta con la Pasteur.

8. Finalmente, vertemos el contenido de la bureta en el agua muestra gota a gota mientras agitamos la muestra hasta que torne a un color pardo rojizo (teja), cerramos la bureta, y la cantidad que se haya gastado en la bureta se multiplica por 10(porque son 100ml) y por 3,55 para que dé el resultado que precisamos.

.

 4.- MATERIAL Y REACTIVOS:

- Matraz aforado 100 ml (valorante)

- Matraz aforado 50 ml (indicador)

- Espátula

- Embudo x2

- Pipeta Pasteur x3

- Vidrio reloj x2

- Probeta

- Matraz Erlenmeyer

- Vaso de precipitado x2

- Bureta 25 ml

- Valorante AgNO3 (Nitrato de Plata)

- Indicador K2Cr04 (Cromato potásico)

- HNO3

- CaCO3

5.- CÁLCULOS:

AgNO3 à 0,1N

N= M·Val   à    0,1 =M·1  à   M=0,1/1  0,1M

M=g/pm/V(L) à g=0,1·0,1(L)·169,87= 1,69g

6.- RESULTADOS:

1,9·10·3,55= 67,45 mgCl/L

Tinción de gram

TINCIÓN DE GRAM

PRÁCTICA 6

1.- OBJETIVOS:

Tincionar una muestra para ver los microorganismos que se encuentran en el
portaobjetos.

                                  2.- FUNDAMENTO:




Diferenciar mediante la tinción entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram positiva.

Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de 2 clases de ácidos teicoicos, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior por medio de lipoproteínas. Ambos tipos de bacterias se tiñen diferente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha más proporción que las Gram negativas. 

3.- PROCEDIMIENTOS:

1.- Tomamos un portaobjetos y colocamos una gota de solución salina siempre que la muestra no este ya diluida.

2.- Tomamos la colonia y la disgregamos.

3.- Dejamos secar la preparación al aire o bien calentando muy suavemente.

4.- Fijar a la llama pasándola 4 o 5 veces por ella.

5.- Inundar el portaobjetos con cristal de violeta 1 min.

6.- Lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante.

7.- Cubrir con lugol 1 min.

8.- Lavar con agua el exceso de lugol.

9.- Decolorar dejando caer el alcohol-acetona 7:3 gota a gota sobre el portaobjetos inclinado, hasta que no se desprenda color. no superar 1 min con la decoloración.

10.- Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

11.- Inundar con safranina durante otro min.

12.- Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

13.- Secar la preparación.

14.- Examinar al microscopio con el objetivo 100X y aceite de inmersión.

4.-MATERIALES Y REACTIVOS:

- Cubeta de cristal

- Puente de tinción

- Mechero bunsen

- Vaso de precipitado

- Pipeta Pasteur x3

- Asa de siembra

- Portaobjetos

- Agua destilada

- Papel secante

- Lugol

- Acetona (30% acetona y 70% Etanol)

- Safranina

- Cristal violeta

5.- RESULTADOS:

COCOS Y BACILOS