1.- OBJETIVO:
Esta práctica consiste en determinar el número de coliformes fecales que se
encuentran en un cultivo microbiano.
2.- FUNDAMENTOS:
Se basa en la determinación del número de coliformes presentes en una
muestra mediante la siembra de distintos volúmenes del agua problema y una
posterior resiembra en un medio de cultivo selectivo con incubación a
temperaturas adecuadas. Para ello se cultiva la muestra en un medio de Agar
Levine o Agar EMB Levine que es un medio de cultivo usado para el
aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque
naranja tras su esterilización, es semisólido.
Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de
enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y
permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de
lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de
color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.
3.- MATERIALES Y REACTIVOS:
- 4 tubos de ensayo
- Una gradilla
- Agua destilada estéril
- Muestra de agua
- Mechero
- Micropipeta
- Placas Petri con agar Levine
- Boquillas de la micropipeta estériles
- Pipeta de 10 ml con su pipeteador
- Asa de digralsky
4.- PROCEDIMIENTOS:
En primer lugar tenemos que realizar una serie de diluciones seriadas que
utilizaremos para posteriormente realizar la siembra en placa.
Pondremos 4 tubos de ensayo en una gradilla y echaremos en cada uno de
ellos 9 ml de agua destilada estéril que cogeremos con una pipeta de 10 ml,
esta agua la tendremos preparada previamente.
Vertimos los 9 ml del agua estéril en cada uno de los tubos de ensayo, hasta completar
los 4 que tenemos.
Seguidamente, cogemos con una micropipeta y una punta estéril 1 ml del agua de muestra y la depositamos en el primer tubo. Cogemos con la misma punta sin cambiar otro ml del primer tubo después de haberlo depositado y lo vertimos en el segundo.
Cogemos otro ml del segundo y lo vaciamos en el tercero, así hasta el cuarto.
Una vez que tengamos preparados los tubos, procederemos a realizar la
siembra en las placas Petri. Aquí utilizaremos nuestro mechero bunsen para
mantener buenas condiciones de esterilidad, y utilizaremos 4 placas Petri con
agar Levine para cada uno de los tubos. Una vez que tenemos nuestro
mechero encendido, comenzaremos la siembra.
Cogeremos la micropipeta de 1 ml y una punta estéril para que
coger 1 ml del tubo 1, iremos echando desde el tubo más
concentrado al tubo menos concentrado en cada una de las placas. Ese mililitro
lo echaremos en la placa Petri e inmediatamente de haberlo echado, lo
repartiremos con el Asa de digralsky, (previo haberlo esterilizado con alcohol
y el mechero bunsen), que es un instrumento que se utiliza para
repartir por toda la placa de forma uniforme toda la muestra.
Este proceso lo realizaremos con las 4 placas. Una vez terminado, rotularemos
cada placa poniendo en cada una de ellas la fecha en la que se ha realizado la
siembra, lo que se está sembrando y en este caso el número del tubo al que
corresponde la muestra.
Dejaremos secar las placas hasta que el líquido se haya absorbido casi en su
totalidad.
Por último, llevaremos las placas a la estufa, que estará a una temperatura de
44º para que puedan proliferar bien los microrganismos.
Después de dejarlas 24 horas aproximadamente, las sacaremos de la
estufa y podremos realizar el recuento de coliformes fecales.
Para hacer el recuento tenemos varias formas, en primer lugar podemos usar
el método del contador de colonias, que es un aparato con luz, un puntero, una lupa y
una pantalla digital, en el que cada vez que pulsas te cuenta una UFC (unidad
formadora de colonia), y también podemos realizarlo a ojo, contando las UFC
de solo una mitad y luego multiplicarlo por dos, o bien dividirlo entre 4,
contar solo 1 y multiplicar por 4 para obtener el número concreto
que hay en la placa.(SOLO SE SUELEN RECONTAR LAS PLACAS PETRI CON UN
CRECIMIENTO DE ENTRE 30 A 300 UFC).
5.- CÁLCULO Y RESULTADOS:
Finalmente utilizaremos una fórmula, para obtener el número de UFC que hay
en una placa.
Nuestros resultados fueron los siguientes:
UFC/ml= 570.10/1= 5700 UFC/ml
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